Методы контрастирования



Методы исследования и контрастирования в световой микроскопии

Основным методом наблюдения в световых микроскопах является метод светлого поля: наблюдатель видит изображение объекта на светлом фоне. Такой метод наблюдения реализуется во всех световых микроскопах. Современные микроскопы, начиная со студенческих, можно доукомплектовать модулями различных методов контрастирования. Эти модули изменяют интенсивность света различными способами. Рассмотрим разные методы исследования и контрастирования на примере нашего оборудования и микрофотографий.
Но давайте дадим определение:

Методы контрастирования –  методы получения изображения объекта с возможностью получения максимальной детализации и информации об изучаемом объекте.


Метод светлого поля в проходящем свете.
Это основной метод исследования и контрастирования. Его используют при просмотре и  изучении тонких окрашенных,  полупрозрачных объектов и т.п. Источник освещения находится снизу препарата ( в прямых микроскопах), либо сверху (в инвертированных микроскопах). Изображение хорошего качества получается после реализации принципа Кёллера, поэтому всегда необходима правильная настройка освещения.
Фото 1. Панцирь диатомовой водоросли Stauroneis rex. Метод контрастирования: светлое  поле в проходящем свете.

Метод косого освещения.
Это разновидность метода светлого поля. Разница между ними состоит в том, что свет на объект направляют под большим углом и это создаёт "рельефность" объекта.
Фото 2.  Панцирь диатомовой водоросли Stauroneis rex. Метод контрастирования: светлое  поле в проходящем свете, косое освещение.

Данный метод можно реализовать с помощью различных конденсоров прямого и косого освещения, вставок (дисков) с вырезами, слайдеров с регулируемым углом и т.п.
Фото 3. Конденсор прямого и косого освещения ОИ-14.

Фото 4. Слайдер для реализации косого освещения в микроскопах серии Jenamed

Фото 5. Диски для реализации метода косого освещения в микроскопах, имеющих в конденсоре откидное кольцо для светофильтров.



Метод светлого поля в отражённом свете. 
Этот метод светлого поля в отраженном свете.Свет от источника освещения проходит через объектив, попадает на объект, отражается от него и вновь проходит через объектив.

С помощью такого метода  изучают структуру не прозрачного объекта. В качестве объекта чаще выступает тонкая пластинка металлов, поэтому эти микроскопы называют металлографическими. Но с помощью метода светлого поля в отражённом свете можно изучать другие материалы, в том числе бумагу, ткани и т.д.
Фото 6. Поверхность микросхемы. Метод контрастирования: светлое поле в отражённом свете.


Метод тёмного поля.
Метод основан на эффекте, который достигается освещением объекта полым конусом света, при этом сами лучи на попадают на объект: внутренняя апертура должна превосходить числовую апертуру применяемого объектива. При использовании этого метода мы видим в окуляр тёмное поле,  если нет изучаемого объекта и видим на тёмном фоне объект, если мы изучаем этот объект. Чаще этот метод используется для наблюдения бактерий, полупрозрачных живых организмов и др.
Фото 7. Панцирь диатомовой водоросли Stauroneis phoenicenteron, пробы фитобентоса из водоёма природного парка "Птичья гавань" (Омск). Метод контрастирования: тёмное поле в проходящем свете.

Реализация этого метода возможна при использовании специального конденсора тёмного поля или слайдеров со специальными диафрагмами для конкретной апертуры объектива.
Фото 8. Конденсор тёмного поля ОИ-13.

Фото 9. Специальные слайдеры для реализации метода тёмного поля. Тёмный диск располагается в плоскости апертурной диафрагмы и закрывает центральный пучок света.

Метод фазового контраста.
Данный метод используют для обнаружения, изучения прозрачных и полупрозрачных объектов, не видимых при использовании метода светлого поля или используют для выявления некоторых особенностей изучаемых объектов. При использовании данного метода изменяется условие освещения для наблюдения слабоконтрастных биологических объектов в неокрашенном состоянии.
Фото 10. Панцирь диатомовой водоросли Stauroneis rex. Метод контрастирования: переменный фазовый контраст.

Фото 11. Набор для реализации фазового контраста на микроскопах серии Jenamed.

Фото 12. Устройство фазового контраста КФ-4 для микроскопов типа Биолам.

Объективы для фазового контраста имеют специальную маркировку: Ф, Ph, Phv. Эти объективы имеют внутри фазовый элемент с кольцом, нанесённым специальным способом. Это кольцо изменяет фазу и уменьшает амплитуду световой волны. Отличительной особенностью в изображении является наличие гала-эффекта по контуру объекта и серый фон.

Объекты могут выглядеть темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).


Поляризованный свет
Метод связан с визуализацией объекта или его элементов в поляризованном свете в результате изменения направления поляризации света и проявления анизотропных свойств объекта.
Для реализации этого метода необходимо иметь два поляфильтра: в осветительной части - поляризатора, а между объективом и окуляром - анализатора. Эти поляфильтры необходимо повернуть относительно друг друга на 90º. При этом в поле зрения наблюдается максимальное затемнение. Если наблюдаемый объект обладает поляризующими свойствами, то на тёмном фоне появляется светлое или разноцветное изображение объекта. Очень часто с поляроидами используют различные компенсаторы.
Фото 13. Микрокристаллы парацетамола. Метод контрастирования: поляризованный свет с компенсатором лямбда.

Фото 14. Набор для поляризации для микроскопов серии Jenamed. Слева направо: слайдер с поляризатором, слайдер с анализатором, слайдер с компенсатором лямбда.

Фото 15. Два поляфильтра, которые можно использовать в качестве поляризатора и анализатора во многих учебных микроскопах.

Метод дифференциально-интерференционного контраста (ДИК).
Данный метод основывается на поляризационных свойствах света. С помощью скрещенных поляроидов создают поляризованный свет и вводят в него две двулучепреломляющие призмы (чаще это призмы Волластона): одна - в конденсор, другая - над объективом. Действие призм заключается в раздвоении проходящего через объект светового пучка: на обыкновенный и необыкновенный лучи, а также в создании фазового сдвига между этими пучками. В результате применения данного метода наблюдается объёмное контрастное изображение объекта или его элементов.
Неокрашенные микрообъекты, имеющие "значительную" толщину, плохо просматриваются, поэтому лучше применять метод ДИК.
Фото 16. Живая диатомовая водоросль. Хорошо виден рельеф хлоропласта, невидимый при других методах контрастирования.
Метод контрастирования: дифференциально-интерференционный контраст по Pluta 

Фото 17. Набор для реализации метода ДИК. Слева направо: поляризатор с компенсаторами, револьверное устройство с призмами Волластона для конденсора, призма Волластона для объектива, анализатор.

Комментариев нет:

Отправить комментарий